Kebutuhan bahan pangan terus meningkat sejalan dengan bertambahnya jumlah penduduk dan tingkat konsumsi domestik yang masih tinggi. Permasalahan yang seringkali dihadapi penduduk dunia secara umum adalah masalah ketahanan pangan, salah satunya keterbatasan lahan dan cekaman lingkungan pertumbuhan. Menurut Schulze, et al. (2005) Tanaman memang organisme yang hidup di berbagai kondisi lingkungan, dan seringkali harus menghadapi berbagai macam stres atau cekaman . Tumbuhan itu sendiri memiliki sistem untuk mengatasi masalah tersebyt, seperti dengan kehadiran gen SWEET yang dalam penelitian Feng et al. (2015) memiliki peran pada peningkatan toleransi tanaman terhadap berbagai macam cekaman lingkungan.
Menurut Gautan et al. (2022) Sugars Will Eventually be Exported Transporters (SWEET) adalah jenis transporter uniport terbaru yang memfasilitasi difusi dari molekul gula melalui membran sel dan ditemukan lebih banyak pada tumbuhan dibandingkan pada hewan, sekitar > 30 tanaman sudah teridentifikasi memiliki gen ini, dimana pertama kali ditemukan pada Aradopsis dalam penelitian Chen, et al pada 2010.
SWEET pada tumbuhan berperan dalam perkembangan tumbuhan karena fungsinya sebagai transpor gula yang memiliki peran penting dalam sistem regulasi dan energi. Selain itu, SWEET juga diketahui memiliki potensi lain seperti pertahanan terhadap penyakit dan dari cekaman abiotik. Hal ini dibuktikan pada tanaman padi, dimana setiap ekspresi gen SWEET ini memiliki peran yang berbeda, seperti pada cekaman ketersediaan air yaitu kekeringan menginduksi gene OsSWEET12, OsSWEET15 and OsSWEET16. Adapun saat cekaman suhu tinggi menginduksi gene OsSWEET14 and OsSWEET16, tetapi menekan ekspresi gene OsSWEET3b, OsSWEET4 and OsSWEET5. Sedangkan pada cekaman suhu dingin menginduksi pengekspresian gen OsSWEET7c dan OsSWEET14. Untuk itu, identifikasi gen SWEET pada tanaman pangan dapat membantu pengembangan bioteknologi bidang pertanian untuk ketahanan pangan dalam menghadapi cekaman abiotik dengan menggunakan teknologi Next-generation sequencing (NGS).
Namun sebelum melakukan analisis tingkat pengekspresian SWEET gene, terlebih dahulu harus memastikan keberadaan gen tersebut pada tanaman pangan target, seperti pada Gambar 1. Hal pertama yang harus dilakukan adalah mengunduh urutan genom tanaman target yang tersedia pada database online, kemudian urutan gen Arabidopsis thaliana dan padi dapat diunduh melalui TAIR 10 database untuk dijadikan kueri dalam pencarian SWEET gen pada tanaman target nanti dalam BLASTP NCBI. Gen tanaman pangan yang di BLAST dilihat nilai kueri yang muncul, jika pada tampilan hasil BLAST menunjukkan nilai kueri lebih dari 10% dengan SWEET gene dari tanaman padi dan Aradopsis artinya gen gersebut memiliki kecocokan atau kesamaan urutan yang mengindikasikan golongan yang sama yaitu SWEET gen. Analisis selanjutnya menggunakan PFam dengan mengidentifikasi domain MtN3 Saliva (SWEET gene) untuk mengidentifikasi lebih lanjut mengenai keberadaan SWEET gene dimana keberadaan MtN3_saliva ini menjadi ciri SWEET gen. Selanjutnya, untuk mendapatkan hasil urutan sekuens yang baik (lengkap) maka digunakan perangkat lunak FGENESH. Setelah didapatkan hasil SWEET gen pada tanaman pangan target, langkah selanjutnya adalah mengukur tingkat pengekspresian gene tersebut menggunakan NGS pada cekaman abiotik seperti panas dan dingin. Cekaman abiotik seperti panas dan dingin sebagai variabel bebas, hal ini dimaksudkan untuk mengetahui seberapa besar pengaruh SWEET gene dalam pertahanan tanaman dan kelompok gen mana saja yang berperan dalam pertahanan terhadap cekaman tertentu. Baru kemudian setelah beberapa waktu tanaman tersebut tumbuh, dilakukan isolasi RNA dari tanaman tersebut. Isolasi RNA dilakukan pada setiap tanaman perlakuan dari bagian tumbuhan yang sama, contohnya dari daun atau batang.
Gambar 1. Ilustrasi Identifikasi Gen SWEET pada Tanaman Pangan Target.
Menurut Godwin (2016) Next-generation sequencing (NGS) adalah metode sekuensing gen untuk mendeteksi lebih dari satu kelainan genom secara bersamaan dalam sekali pemeriksaan tanpa spesimen genetik dalam jumlah banyak, baik DNA maupun RNA. Teknologi ini merupakan pengembangan dari metode Sanger, dimana NGS menggabungkan keunggulan kimia pengurutan yang unik, matriks pengurutan yang berbeda, dan teknologi bioinformatika yang memungkinkannya untuk melakukan pengurutan paralel besar-besaran dari berbagai rangkaian panjang DNA atau RNA atau bahkan seluruh genom dalam periode waktu yang relatif sangat singkat. Pada metode NGS terdapat beberapa prinsip yang diterapkan dan prinsip tersebut diaplikasikan pada sebuah alat, salah satu yang paling umum dikenal adalah Illumia (Solexa) Sequencing. Illumina merupakan contoh dari sequencing by synthesis dimana penambahan nukleotida sekaligus 4 basa dan basa yang berikatan akan menghasilkan fluorescent sedangkan sisanya akan dibilas/dihilangkan. Sequencing berlangsung dengan fragmen yang membentuk bridge pada bidang datar dimana adaptor yang ada pada fragmen akan menempel dengan komplemennya di bagian bidang datar.
Untuk mengidentifikasi tingkat pengekspresian gen SWEET pada tanaman pangan dapat memanfaatkan teknologi Illumina dengan RNA sequencing, dapat dilihat pada Gambar 2. RNA seq adalah teknik dalam transkriptomik yang digunakan untuk mengukur gen. RNA seq dapat memberikan data kuantitatif dan kualitatif mengenai suatu gen, baik yang sudah diketahui maupun gen baru. Terdapat prosedur dalam melaksanakan RNA seq menggunakan teknologi Illumina, dimana terdapat 4 langkah utama, yaitu mempersiapkan RNA, persiapan RNA diawali dari ekstraksi RNA dari tanaman target, kemudian RNA tersebut perlu diubah menjadi DNA dengan melakukan reverse transcriptome (Transkripsi balik) sehingga menghasilkan cDNA. Lalu mempersiapkan Library untuk NGS, cDNA tadi kemudian di fragmentasi. Fragmentasi ini bertujuan untuk menyesuaikan ukuran dengan sistem NGS yang dipakai (50-500 bp). Setelah itu, di setiap ujung fragmen cDNA dipasang adapters, dimana adapter ini adalah elemen yang berfungsi untuk memfasilitasi amplifikasi dan sekuensing.Persiapan library ini juga termasuk proses amplifikasi. Kemudian sequencing, sequencing library yang dihasilkan setelah proses amplifikasi adalah menggunakan Illumina (Solexa) sequencing yang menggunakan prinsip sequencing by synthesis yang akan menghasilkan fluorescent dalam prosesnya dan direkam sehingga didapatkan urutan basa. Analisis dan Interpretasi untuk mengetahui gen SWEET dilakukan dengan membandingkannya hasil RNA seq dengan data gen SWEET tanaman padi dan aradopsis yang tersimpan dalam database NCBI. Selain itu, pengukuran ekspresi gen juga dilakukan untuk mengetahui tingkat pengekspresian gen tertentu pada tanaman target untuk mengetahui seberapa besar pengaruh gen tersebut. Warna menjadi cara identifikasi tingkat ekspresi gen yang ada, dimana warna merah artinya tingkat ekspresi gen tinggi, semakin gelap warna merah yang ada maka semakin tinggi tingkat ekspresi gennya. Sebaliknya, warna hijau mengindikasikan ekspresi gen yang rendah.
Gambar 2. Visualisasi Langkah Kerja Metode RNA-Sequencing dalam Menentukan Tingkat Ekspresi Gen SWEET pada Tanaman Pangan.
Setelah dapat mengidentifikasi gen SWEET pada tanaman pangan lain selain padi dengan RNA seq memanfaatkan NGS dalam teknologi Illumina ini dapat menjadi langkah awal untuk pengembangan tanaman pangan yang tahan terhadap cekaman abiotik.
Referensi:
Dash, H.R., Elkins, K.M. and Al-Snan, N.R. eds., 2023. Next Generation Sequencing (NGS) Technology in DNA Analysis. Elsevier.
Płoski, R., 2016. Next generation sequencing—general information about the technology, possibilities, and limitations. In Clinical Applications for Next-Generation Sequencing (pp. 1-18). Academic Press.