Gunting Molekuler sebagai Teknologi Editing Gene Tool Masa Depan

Ditulis oleh Ririn Pratiwi

blank
Gambar 1. Emmanuelle Charpentier (kiri) dan Jenifer Doudna (kanan)

Baru-baru ini ada kabar bahagia di bidang biokimia dan biologi molekuler. Emmanuelle Charpentier dari Prancis dan Jenifer Doudna dari U.S baru saja mendapatkan nobel atas penelitiannya tentang gene editing tool – CRISPR-Cas.

Adanya sistem pertahanan dari prokariotik berupa CRISPR-Cas adalah cerita dibalik suksesnya biological genome editing tool pada sistem eukariota. High precision genome editing sebelumnya yaitu RNA guided engineered nucleases (RGENs), Zinc Finger Nucleases (ZFN) dan Transcription-Activator-Like-Effector Nucleases (TALENs).

Tahun 2013 ditemukan Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR) yang dikenal sebagai the next generation genome tool yang pengaplikasiannya tidak hanya terbatas pada lalat buah, ulat sutra, cacing gelang dan tikus.

CRISPR merupakan sebuah sistem yang bertanggung jawab dalam membentuk imunitas adaptif pada 40% bakteri seperti Streptococcus pyogenes, Staphylococcus aureus, Neissera meningitides, Staphylococcus epidermidis, S. mutans, S. thermophilus, E.coli dan lain sebagainya. Pemanfaatannya dapat digunakan untuk mengubah, memperbaiki, mengganti, delesi dan insersi bagian DNA pada sel mahkluk hidup.

Diagram Description automatically generated
Gambar 2. Komponen RNA guide, Cas9 dan target sekuens

Dua komponen utamanya berupa Cas9 (endonuclease) yang bertindak sebagai gunting molekuler dan sgRNA (Single guide RNA) yang menjadi pemandu Cas9 mencapai target. Jika diibaratkan dengan sistem komputer cara kerjanya seperti find, cut dan paste.

Bagaimana mekanisme kerjanya?

Sistem CRISPR-Cas berguna untuk merusak double strand DNA target, dimana gen baru atau gen yang dikehendaki akan disisipkan (tertarget pada lokasi tertentu). CRISPR lebih spseifik dibanding mutagenesis acak seperti radiasi, ZFNs dan TALENs karena memiliki konformasi struktur protein yang unik. Hasil analisa komputasi CRISPR-Cas9 tergambar sebagai struktur bersegi banyak yang pertama kali ditemukan pada Streptococcus aureus yang memecah genom virus.

Protein cas9 yang disebut sebagai gunting molekuler ini tersusun atas 6 bagian, yaitu:

REC-1 (Recognizing Domain-1) yang berfungsi mengikat dan mengarahkan RNA
REC-2 yang memulai pengikatan untuk membangun struktur DNA
PAM (Protospacers Adjacent Motif sequence) yang menggunting DNA target. Strukturnya terdiri dari 20 urutan nukleotida
RuvC yang menggunting untai DNA non-komplementer
Bridge helix yang menghubungkan REC dan PAM
Amino acid sequence of His-Asn-His (HNH) yang menggunting untai komplementer

Sebelumnya, telah teridentifikasi berbagai macam tipe protein Cas, antara lain tipe I (Cas 3 dan 6), tipe II (Cas 9) dan tipe III (Cas 10). Cas9 paling banyak diteliti karena ketersediaannya yang melimpah dan paling banyak terdapat di berbagai spesies bakteri.

Diagram Description automatically generated
Gambar 3. Mekanisme kerja CRISPR-Cas9

Saat pertama kali virus menyerang, sistem CRISPR-Cas yang diekspresikan adalah Cas1 atau Cas2. Kemudian, Cas ini akan mengambil genom penyerang lalu mengintegrasi fragmennya ke dalam susunan urutan CRISPRnya sendiri dalam membentuk kekebalan. Pertahanan berikutnya apabila ada DNA asing masuk lagi ke dalam sel bakteri maka genom bakteri akan teraktivasi dimulai dari sintesis pra-cr RNA (proses 1,2 dan 3). Kemudian terjadi ligase antara pra-cr RNA dengan transaktivasi cr-RNA (trans-crRNA) untuk membentuk guide RNA (proses 4). Enzim Cas9 kemudian membentuk kompleks dengan RNA pemandu namun masih belum aktif (proses 5). Lalu, kompleks ini kemudian mendeteksi DNA asing (cocok dengan sekuens dari PAM) dan membentuk ikatan. Dengan bantuan RNase III, kompleks tersebut akan melakukan fragmentasi (memotong) DNA asing (membuka duplex DNA).

Diagram Description automatically generated with low confidence
Gambar 4. DNA terpotong dan mengalami perbaikan

Setelah terpotong (double strand breaks) DNA tersebut dibiarkan secara alami melakukan perbaikan (proses 5, 6 dan 7). Ada dua cara perbaikan alamiah DNA, yaitu Non-Homolog End Joining (NHEJ) dan Homology Directed Repair (HDR). NHEJ sendiri bersifat menghancurkan gen dan aplikasinya diterapkan untuk terapi gen. Sementara, HDR dapat mengubah sekuens DNA secara akurat atau editing gene untuk perbaikan genetika.

Penerapan CRISPR-Cas9

Editing genom

Diagram Description automatically generated
Gambar 5. Penambahan gen

Tanaman yang penting secara komersial seperti Oryza sativa (beras), Zea mays (jagung) dan Solanum lycopersicum (tomat) sedang dilakukan penelitian dengan sistem CRISPR-Cas untuk mengekspresikan sifat yang dikehendaki. Penyisipan, penghapusan dan modifikasi dari regulasi transkripsi terutama digunakan untuk mengubah genom tanaman. Transformasi tanaman sebagian besar dilakukan oleh Agrobacterium sp. dengan tehknik particle bombardment.

Eliminasi DNA virus

.

.

Diagram Description automatically generated
Gambar 6. Penghapusan gen

Acquired Immunodeficiency Syndrome (AIDS) suatu kondisi dimana jumlah sel T CD4+ sangat sedikit, akibatnya pasien dapat meninggal karena infeksi oportunistik. Perlakuan pada tikus Severe Combined Immune Deficiency (SCID) yang memiliki sel Peripheral Blood Mononuclear (PBMC) yang berasal dari pasien HIV-I positif, dilakukan penyuntikan intravena DNA CRISPR. RNA guide dan Cas9 yang dimediasi oleh virus yang menghasilkan genom HIV-I di bagian yang ditargetkan, dan akhirnya mengurangi fragmen DNA virus HIV-I dalam darah, paru-paru, limpa dan liver tikus.

Koreksi mutasi.

Diagram Description automatically generated

Gambar 7. Koreksi gen

Duchenne Muscular Dystrophy (DMD), gangguan yang ditandai dengan degenerasi otot bertahap. Pendekatannya adalah dengan menghapus daerah target mutasi ekson 45 sampai 55 pada pasien DMD..

Menghancurkan gen

blank
Gambar 8. Menonaktifkan gen

Malaria yang disebabkan oleh gigitan nyamuk Anopheles gambiae dengan parasit Plasmodium falciparum yang mengandung gen Fibrinogen Related Protein-1 (FREP) dapat menyebabkan infeksi parasit pada manusia. CRISPR diuji untuk menonaktifkan gen FREP-1 dengan menyuntikkan sgRNA sintetis dan Cas9 ke dalam embrio A.gambie dan terbukti menghasilkan penekanan infeksi.

Sesuai peristiwa yang tercatat, para ilmuwan berhasil memperkenalkan alat ini untuk diterapkan, mulai dari genom editing hingga menyembuhkan kelainan genetik pada manusia. Meskipun sistem CRISPR-Cas9 dapat memerangi penyakit yang mengancam jiwa seperti kanker, Alzheimer dan gangguan kardiovaskular tetapi penggunaannya belum mengatasi hambatan dilema etik. Berdasarkan berbagai perspektif penggunaan alat ini tidak diperbolehkan untuk pengobatan pada manusia maupun pada tingkat fertilasi in vitro.

Pengubahan gen demikian akan memunculkan sejumlah tantangan etis, termasuk apakah akan diperbolehkan menggunakan teknologi tersebut untuk meningkatkan sifat manusia yang normal (seperti tinggi badan dan kecerdasan). Atas dasar kekhawatiran terhadap etik dan keamanannya, maka pengubahan sel germinal dan gen embrional saat ini masih illegal di banyak negara. Pembahasan lainnya, CRISPR masih memiliki masalah terkait potensi kegagalan atau keberhasilannya. Kegagalan mengubah gen menyebabkan individu akan terpapar resiko efek samping. Di samping semua kontroversi tersebut, sampai saat ini CRISPR masih menjadi satu-satunya teknik pengubahan gen di masa yang akan datang dengan kemudahannya, harga yang lebih murah dan efisien. Namun, teknologi yang cukup baru ini masih membutuhkan banyak penelitian dan uji coba lanjutan agar dapat digunakan dengan lebih baik.

Referensi :

Swaraj M, Pradhan CK, Dash A. 2019. CRISPR-Cas9 Technology: A Magical Tool For DNA Editing. Odisha. Department of Biotechnology. Vol I, No.1, pg 1-12.

Angeline WK. 2020. CRISPR-Inovasi Biologi Molekuler dan Medis yang Kontroversial. Medan. Kalbemed. Vol. 47, No. 3, pg 218-221.

https://www.aiche.org/chenected/2020/10/nobel-prize-chemistry-2020-awarded-emmanuelle-charpentier-and-jennifer-doudna diakses 27 Juni 2021.

.

Setelah selesai membaca, yuk berikan artikel ini penilaian!

Klik berdasarkan jumlah bintang untuk menilai!

Rata-rata nilai 0 / 5. Banyaknya vote: 0

Belum ada yang menilai! Yuk jadi yang pertama kali menilai!

Baca juga:
Warung Sains Teknologi
Artikel Berhubungan:

Tinggalkan Balasan

Alamat email Anda tidak akan dipublikasikan. Ruas yang wajib ditandai *