Jalan Panjang Molekul α-ketoamida Melawan Virus Korona

Organisasi Kesehatan Dunia (WHO) telah mengumumkan dan merekomendasikan beberapa jenis obat untuk diuji cobakan. Keempat jenis obat tersebut terdiri dari remdesivir, chloroquine dan hydroxychloroquine, lopinavir and ritonavir serta interferon-beta. Sebelumnya obat-obatan tersebut telah digunakan untuk penanganan penyakit tertentu. Misalnya chloroquine dan hydroxychloroquine telah digunakan untuk penyakit malaria [1]. Selain obat-obatan yang telah direkomendasikan tersebut, terdapat obat lain yang sedang dikembangkan oleh institusi riset, perguruan tinggi hingga perusahaan berbasis medis dan bioteknologi. Molekul α-ketoamida merupakan satu dari sekian banyak obat yang dikembangkan. Universität zu Lübeck (Jerman) merupakan salah satu perguruan tinggi yang mengembangkannya. Molekul tersebut telah diuji cobakan sebagai inhibitor (penghambat) aktivitas pada dua sub grup virus korona yang menginfeksi manusia sebelumnya. Sebuah laporan ilmiah menyebutkan inhibitor tersebut telah diujicobakan pada HCoV-229E (sub grup alfa) serta MERS-CoV dan SARS-CoV (sub grup beta) [2].

Pada suatu reaksi biokimia, inhibitor merupakan molekul yang berfungsi sebagai penghambat reaksi enzim [3]. Komponen pada virus korona yang dijadikan sasaran dengan penggunaan inhibitor tersebut adalah protease utama (Mpro). Molekul protease utama atau juga dikenal dengan 3C-like protease (3CLpro) termaksud dalam kelompok protein non struktural yang dikodekan oleh genom ORF1 (Open Reading Frame 1) [2,4].

Protease utama merupakan enzim yang sangat berperan pada pembentukan poliprotein (pp1a dan pp1ab) melalui translasi RNA virus korona. Kedua poliprotein tersebut merupakan protein nonstruktural dan sangat berperan dalam replikasi (perkembang biakan) virus korona. Pada virus korona sebelumnya (SARS-CoV) protease utama terletak pada protein non-struktural 5 (nsp 5) dan bertanggung jawab terhadap adanya 11 sisi pemecah pada strukturnya. Secara lebih spesifik bagian sisi pemecah inilah yang dijadikan target sasaran oleh α-ketoamida untuk menghambat aktivitas protease utama. Lebih lanjut penghambatan aktivitas protease utama akan mencegah replikasi (perkembang biakan) virus korona [2,4].

Terdapat suatu kekhawatiran apabila virus korona dapat memiliki sifat yang berlainan dan beragam ketika bereplikasi. Yang pasti munculnya virus korona jenis baru ini telah membuat peneliti berusaha untuk meningkatkan kemampuan inhibitor α-ketoamida. Upaya yang dilakukan adalah melakukan modifikasi struktur pada inhibitor tersebut.

Molekul protease pada manusia tidak memiliki sisi pemecah spesifik seperti yang dimiliki virus korona, sehingga inhibitor α-ketoamida tidak akan bersifat toksik (racun) bagi tubuh. Pernyataan tersebut disampaikan oleh sekelompok peneliti yang mengembangkan inhibitor α-ketoamida untuk virus SARS-CoV-2 [2] .

Tahap awal sintesis α-Ketoamida adalah dengan mereaksikan molekul N-Boc glutamic acid dimethyl ester dengan bromoacetonitrile (reaksi alkilasi dianionik). Hasil reaksi tersebut merupakan molekul dasar Inhibitor α-ketoamida  sebelum melewati serangkaian reaksi yang panjang. Hidrogenasi, siklisasi, hidrolisis, dan oksidasi adalah beberapa tahapan reaksi sebelum diperoleh inhibitor α-ketoamida yang akan diujikan terhadap virus korona dan yang lainnya. Modifikasi subsituen (gugus) pada struktur inhibitor ini dilakukan pada posisi P1, P2 dan P3 (struktur 11a-11u Gambar 4) [5].

Uji coba secara in vitro inhibitor α-ketoamida telah dilaporkan oleh sekelompok peneliti. Percobaan tersebut menggunakan sel hidup yang ditumbuhkan di laboratorium dan telah terinfeksi virus korona. Dari hasil percobaan tersebut, inhibitor dengan struktur 11r α-ketoamida (kiri atas pada Gambar 3) merupakan struktur modifikasi terbaik dibanding yang lainnya. Hal ini didasarkan pada penggunaan konsentrasi efektif (EC50) terendah terhadap virus MERS-CoV, SARS-CoV dan keseluruhan jenis enterovirus (virus RNA untai tunggal) lainnya pada variasi sel. Terkait temuan tersebut para peneliti menekankan perlunya memperhatikan kualitas tipe sel yang digunakan. Hal ini dikarenakan kualitas tipe sel akan berpengaruh terhadap aktivitas anti virus [2,5].

Merebaknya pandemik COVID-19 telah telah memantik semangat sekelompok peneliti untuk kembali mengembangkan inhibitor α-ketoamida. Modifikasi struktur inhibitor 11r dilakukan dengan mengganti ikatan amida dengan cincin piridon (Kanan atas pada Gambar 3, 13a; lingkaran hijau). Proses ini bertujuan untuk meningkatkan stabilitasnya dalam plasma dan untuk mencegah pemutusan ikatan pada protease selular. Selain itu juga dilakukan penggantian separuh cinnamoil hidrofobik dengan gugus yang memiliki sifat hidrobik yang tidak terlalu kuat (Gambar 3/11r ke 13a; lingkaran merah). Modifikasi ini bertujuan untuk meningkatkan kelarutan inhibitor dalam plasma dan mencegah terbentuknya ikatan terhadap protein plasma [2].

Pada struktur dengan penambahan cincin piridon (Gambar 3/13a) para peneliti ingin mengujinya terhadap virus SARS-CoV-2. Langkah pertama yang dilakukan adalah analisis struktur kristal 3D protease utama sebagai target pada virus SARS-CoV-2 pada resolusi 1.75 Amstrong (Å) menggunakan X-Ray Kristalografi. Para peneliti mengungkapkan bahwa struktur tersebut memperlihatkan kemiripan sekitar 96% dengan virus korona sebelumnya (SARS-CoV). Molekul protease utama virus SARS-CoV-2 memiliki dua promotor (biru dan orange), 4 domain (angka romawi) dan sisi katalitik pada residu Cys145 dan His41 (bundaran kuning dan biru) (Gambar 5) [2].

Untuk meningkatkan aktivitas anti virus terhadap virus korona sub grup beta (SARS-CoV dan SARS-CoV-2) dilakukan penggantian separuh gugus sikloheksil (Gambar 3/13a) dengan siklopropil yang lebih kecil (Gambar 3/13b, lingkaran biru). Pelindung gugus struktur 13b pada posisi P3 tidak menempati sisi canonical S4 pada protease utama. Hal ini sangat berbeda dengan inhibitor yang dikembangkan sebelumnya terhadap virus SARS-CoV. Inilah yang menjadi salah satu alasan upaya modifikasi struktur terus berlanjut hingga dihasilkan inhibitor struktur 14b [2].

Hasil uji coba terhadap virus SARS-CoV-2 menunjukkan struktur modifikasi inhibitor 13b α-ketoamida  membutuhkan konsentrasi efektif (IC50) lebih kecil pada dua virus korona sebelumnya (SARS-CoV dan MERS-CoV). Konsentrasi efektif yang dibutuhkan untuk menghambat aktifitas protease utamanya yaitu sebesar 0.67 ± 0.18 mikromolar (µM). Penghambatan replikasi virus SARS-CoV-2 terjadi melalui interaksi (reaksi reversibel/dua arah) antara sisi katalitik protease utama (residu Cys145) terhadap gugus α-keto dari inhibitor. Interaksi tersebut membentuk molekul tiohemiketal yang distabilkan ikatan hidrogen dengan residu His41. Selain itu,  oksigen amida pada struktur inhibitor 13b membentuk ikatan hidrogen antara rantai utama amida terhadap residu Gly143, Cys145, dan sebagian pada Ser144 pada protease utama (Gambar 6) [2].

Aktivitas penghambatan replikasi virus SARS-CoV-2 oleh inhibitor struktur 13b dikatakan lebih baik dibanding 14b. Hal ini didasarkan pada penggunaan konsentrasi efektif (EC50) ketika uji coba. Pengamatan aktivitas penghambatan ini dilakukan pada sel paru-paru manusia (Calu3) yang telah diinfeksi dengan virus SARS-CoV-2 (Gambar 7) [2].

Sebuah harapan

Inhibitor struktur 13b telah diujicobakan pada tikus menggunakan alat pernapasan dengan konsentrasi 3mg/kg. Setelah 24 jam sebanyak 33 ng/g ditemukan pada jaringan organ paru-paru. Sistem pernapasan pada hewan uji telah memberikan toleransi yang baik dan tidak menunjukkan efek buruk. Hal ini menandakan bahwa pemberian secara langsung inhibitor ke organ paru-paru memungkinkan untuk dilakukan.

Struktur yang mengandung cincin piridon memberikan hasil uji farmakokinetik yang baik. Penelitian ini telah menyediakan informasi yang berguna untuk pengembangan anti virus korona dimasa mendatang. Saat ini, agen anti virus ini akan dikembangkan hingga menjadi obat, dimana proses ini akan memakan waktu beberapa tahun. Hal tersebut diungkapkan oleh Prof. Rolf Hilgenfeld yang telah meneliti virus korona dan mengembangkan anti virusnya sejak tahun 1999.

Tetapi marilah kita sama-sama berdoa Sahabat Warstek, semoga pengembangan anti virus α-ketoamida dapat mengalami akselerasi dan dunia dapat kembali normal.

Referensi

1. https://www.sciencemag.org/news/2020/03/who-launches-global-megatrial-four-most-promising-coronavirus-treatments#, diakses pada 28 April 2020 pukul 20.45 WITA
2. Linlin Zhang, Daizong Lin, Xinyuanyuan Sun, Ute Curth, Christian Drosten, Lucie Sauerhering, Stephan Becker, Katharina Rox, Rolf Hilgenfeld, 2020, Crystal Structure of SARS-CoV-2 Main Protease Provides a Basis for Design of Improved α-ketoamide Inhibitors, Science, 1-8.
3. Tim Editor, 2006, Oxford Dictionary of Biochemistry and Molecular Biology, Oxford University Press, London.
4. Rolf Hilgenfeld, 2014, From SARS to MERS: Crystallographic Studies on Coronaviral Proteases Enable Antiviral Drug Design (Review Article), FEBS Journal, 281, 4085-4095.
5. Linlin Zhang, Daizong Lin, Yuri Kusov, Yong Nian, Qingjun Ma, Jiang Wang, Albrecht von Brunn, Pieter Leyssen, Kristina Lanko, Johan Neyts, Adriaan de Wilde, Eric J. Snijder, Hong Liu, Rolf Hilgenfeld, 2020, α‑Ketoamides as Broad-Spectrum Inhibitors of Coronavirus and Enterovirus Replication: Structure-Based Design, Synthesis, and Activity Assessment, Journal of Medicinal Chemistry, A-Q.